一、實驗原理

細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)， 即將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。

細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高 細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方 法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。

二、實驗方法

材料：

小鼠，生理鹽水，100ml滅菌燒杯，15ml離心管，培養(yǎng)皿，滴管，無菌鑷子、剪刀，篩網(wǎng)，泡沫板，大頭針，酒精燈，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng) 液，PBS，0.25%胰酶，超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡，顯微鏡，計數(shù)板，離心機，恒溫水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮 罐，凍存管，凍存液，廢液缸等。

方法：

（1）原代培養(yǎng)：

1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺內(nèi)，固定在泡沫板上。

2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開皮膚一個橫切口，將皮膚向上撕開，然后剪開肌肉等，暴露出腹腔，在左側(cè)找到脾臟，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿中。

3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次，并剔除多余無用的組織。

4.將篩網(wǎng)置于平皿中，脾臟置于篩網(wǎng)上，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網(wǎng)上進行碾磨，同時不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。

5.將碾磨好的細胞懸液吸入至離心管中，離心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。

6.加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻，取樣計數(shù)。

7.將稀釋好的細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻，在培養(yǎng)瓶上。

面做好標志，注明細胞、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（2）傳代培養(yǎng)：

1.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代。

2.培養(yǎng)液瓶打開后，過酒精燈火焰，置酒精燈火焰周圍。

3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭，過火，放入培養(yǎng)液瓶中。

4.打開培養(yǎng)瓶，瓶口過火，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。

5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶，用量以薄薄蓋滿一層為宜，37℃消化，倒置顯微鏡下觀察到細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基。

6.取彎頭滴管反復(fù)吹打細胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，制成細胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

7.對半貼壁培養(yǎng)細胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。

（3）凍存：

1.吸取傳代后的細胞懸液，離心，去除培養(yǎng)液，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內(nèi)細胞數(shù)目一般為（5～10）×106個/ml，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細胞）。

2.按步凍存

o冷凍保存方法一：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。

o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長期保存。

（4）復(fù)蘇：

1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無菌操作臺內(nèi)。

2.打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。

3.1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

4.加適當培養(yǎng)液后將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。

三、實驗結(jié)果計算

1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個脾細胞。

2.細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。

3.一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進行傳代。

四、注意事項

1.取材要求新鮮，無菌，解剖小鼠時，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。

2.沖洗脾臟時要盡量洗凈血污，去除無用組織，并要防止組織干燥。

3.碾磨后及時用清水沖洗篩網(wǎng)，防止組織、細胞阻塞網(wǎng)孔。

4.計數(shù)前，注意吸盡平皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個細胞。

5.實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。

6.金屬器械不能在火焰中燒的時間過長，燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。

7.另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞。

8.吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。

9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

10.開啟、關(guān)閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。

11.換液時傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。

12.吹打細胞時，要注意邊角的細胞是否吹打下來。

13.手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。

14.每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。

15.注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

16.從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。

17.將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

18.凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。